第三代測序技術是指單分子測序技術,在測序過程中不需要經過PCR擴增,實現對每一條DNA分子的單獨測序。三代測序技術具有反應速度快、超長讀長,無模板擴增、直接檢測表觀修飾位點、測序錯誤隨機出現,沒有GC或修飾的偏好性等特點。諾賽基因主要應用的測序平臺為是Pacific Biosciences (PacBio) 公司的單分子實時測序技術平臺和Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司的單分子納米孔測序技術平臺。這兩個大平臺也是目前最有代表性的三代測序平臺。

三代測序
服務流程???????
服務內容????????

1) 擴增子測序

2) 全基因組測序

3) 全長轉錄組測序

4) 甲基化測序(具體項目請先咨詢)

??測序技術特點???????

1)單分子測序,大大提高了樣本的通量和檢測的速度;

2)RNA直接測序,大大降低了體外逆轉錄產生的系統誤差;

3)長片段測序,大大提高DNA聚合酶內在自身的延續性(延續性,也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段)

訂購信息????????

電話訂購:400-6789-590   萬經理:13810506625;李經理:13522520637

相關資料:高通量項目-項目信息表(可下載)。

平臺介紹?????

PacBio Sequel 測序平臺

隨著測序技術的不斷推進,以PacBio為代表的第三代基因測序技術逐漸應用到多個科研領域。該平臺是美國太平洋生物技術公司(Pacific Biosciences)基于納米小孔的單分子讀取技術,又稱作單分子實時測序技術SMRT,Single Molecule Real-Time),無需擴增即可快速完成序列讀取。

PacBio Sequel測序儀是201510月推出全新升級的第三代測序平臺,該系統較上一代RSII平臺測序體積減少2/3、通量提高7倍、單Gb數據成本更低、測序周期更短。2019年4月,該公司重磅發布新一代測序系統PacBio SequelⅡ,與PacBio Sequel測序系統相比,PacBio SequelⅡ芯片支持8M SMRT Cell ,單張芯片測序通量提升了8倍,并可產出高精準度的長讀長HiFi reads,堿基準確度可達99.9% 以上,具有測序通量更高、耗時更短、準確度更高、應用更靈活等特點。?

技術原理???????

SMRT技術應用了邊合成邊測序的思想,將測序文庫、DNA聚合酶以及四色熒光基團標記的dNTP放置在ZMW孔(即零模波導孔Zero-Mode Waveguides)底部,進行單個DNA分子的合成反應。在測序過程中,以SMRT芯片為測序載體,以共價結合方式固定的DNA聚合酶和測序模板相結合,根據模板鏈核苷酸順序,對應的dNTP加入發生鏈延伸反應,通過檢測4種dNTP的熒光信號,以及熒光的波長與峰值分析獲得DNA的堿基序列。

平臺優勢???????

平均讀長10-15Kb,最長可達40-70Kb,通量~80 Gb/cell,較二代測序平臺讀長更長,有效解決短序列數據的拼接難題,且時間更短;在極端高GC和極端低GC區域,可以輕松測定,從而保證序列覆蓋的完整性和均一性。建庫過程中,DNA不需要進行PCR擴增,避免了覆蓋度不均一和PCR冗余。

應用領域???????

1)全基因組de novo測序

2)基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制

3)全長轉錄本測序

4)宏基因組測序

5)16S rDNA全長測序

6)細胞器基因組測序

7)全基因組重測序&稀有變異鑒定

8)表觀遺傳學

Pacbio測序實驗流程?

1)高質量總RNA(DNA)的制備;

2)SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech)反轉錄,將 RNA 反轉錄成 cDNA并加接頭序列(DNA直接加接頭);

3)文庫構建(即環化);

4)上機測序。

Nanopore測序平臺

Nanopore平臺是牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies,簡稱ONT)研發的新興實時單分子納米孔測序技術平臺。用于Nanopore平臺測序的DNA或RNA建庫過程簡單直接,最快的建庫方法只需5到10分鐘就可在樣本分子末端添加測序接頭及馬達蛋白。具有測序通量更高、耗時更短、準確度更高、應用更靈活等特點。所有Oxford Nanopore測序設備使用同樣的核心技術,用戶可以輕松根據應用測試實驗以及擴大或縮小規模。從最小型的Flongle和掌上MinION,到桌面型的GridION和PromethION。所有設備都可用于進行按需測序實驗。包括從單次試驗到超高通量項目,全部都可提供快速、長讀長、實時的DNA或RNA直接測序。

技術原理???????

ONT測序平臺通過電信號識別堿基序列。當DNA/RNA單鏈通過納米孔時,不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號,通過對這些信號檢測,可獲得相應堿基類型,完成測序。

1.   解螺旋,將雙鏈DNA解開成單鏈;

2.   DNA單鏈分子通過一個孔道蛋白,孔道中有個充當轉換器的蛋白分子;

3. 進入納米孔的單分子引起特征性的電流干擾,不同的DNA單分子停留在孔道中就會形成特征性離子電流變化信號, 帶來電流不同的變化;

4.不同的堿基帶來的電流變化是不同的, 轉化器蛋白分子可以感受每個堿基的電流變化。

5.  根據電流變化的頻譜,應用模式識別算法得到堿基序列。

平臺優勢???????

理論讀長無限長,試劑讀長受樣品的實際文庫長度限制DNA/RNA直接測序,目前報到處DNA片段長度最高記錄為>2 Mb,直接RNA測序讀長最長為26kb,MinION通量為20Gb/cell,GridION X5 通量為50-100Gb/cell,PromethION通量為Tb級;文庫制備簡單快速,10 分鐘文庫制備;多種型號可選擇,擴增性更強;MinION較Pacbio測序平臺體積小,更便協調、易操作;結構變異的檢測更有優勢;可對RNA進行表達分析。

應用領域???????

1)全基因組de novo測序

2)基因組草圖的優化或基因組完成圖繪制

3)全長轉錄本測序

4)宏基因組測序

5)16S rDNA全長測序

6)細胞器基因組測序

7)全基因組重測序&稀有變異鑒定

8)表觀遺傳學

Nanopore測序實驗流程:

1)高質量總DNA提取;

2)建庫主要是需要給待測DNA兩側先加上A堿基,使平末端變成黏性末端,然后再加上Y接頭以及馬達蛋白;

3)上機測序。

測序方案

MinION:

無需等待的即時測序

能在實驗室外進行實地測序

達到每48 小時10-20 Gb數據量

?MinIno平臺 

特點:袖珍型、便攜式生物分析設備                  

多達 512 個納米孔通道                                  

樣本制備只需10 分鐘,簡單快捷                       

實時分析,工作流程快速高效

適用于 DNA 或 RNA 直接測序

GridION X5:

從事較大的測序項目, 有5 個 MinION 測序芯片(每 48 小時 50-100Gb 數據量)

直接在測序儀上進行堿基序列讀取——無需輔助設施。

PromethION:(暫不提供此平臺的服務)

具有龐大數據量的項目 (Tb) 

能對大量樣本進行按需測序服務

高通量、高樣本數的臺式系統

模塊化設計:多達 48 個測序芯片,各有多達 3,000 個納米 孔通道(總計達 144,000 個)

測序芯片既可單獨也可同時運行

應用于大容量樣品測序,工作流程與 MinION相同

1. PacBioSequel測序平臺建庫的注意事項?

利用PacBio Sequel進行全長轉錄組測序,平臺包含16個測序模塊(SMRT cell),每個SMRT cell包含100萬個零模波導孔(每個零模波導孔為1個測序單元,完成1條DNA分子的測序反應)。需要將 mRNA 進行反轉錄并進行環化處理,形成 CCS,每個零模波導孔將容納 1個CCS分子。由于全長轉錄組測序對mRNA不進行打斷,直接進行上機測序,而每個CCS的片段長度不同,較小的CCS會先落入ZMWs中,而導致長片段很難測到。因此,在文庫構建時,建議將 mRNA 根據長度分成不同的段,分別構建文庫和測序。


2. 全長轉錄組測序分析內容包括哪些?

分析內容包括:轉錄本覆蓋度計算、轉錄本功能注釋、轉錄本GO分類注釋、轉錄本 eggNOG分類注釋、轉錄本KEGG分類注釋、ORF分析、可變剪接分析等。


3.三代測序相比二代測序的優勢有哪些?

三代測序具有長讀長的特點,平均讀長在10-15Kb,而二代測序的讀長為PE150-250bp,所以三代測序拼接效率更高,用低覆蓋度即可完成基因組組裝;并且由于測序過程無需進行PCR擴增,可輕松覆蓋高GC和高重復區域,對低豐度/低頻突變定量更準;對基因組組裝和基因組變異檢測效率更高;另外,利用測序過程聚合酶反應的動力學變化,直接檢測堿基修飾,可以統一分析基因組學和表觀遺傳學數據。


4.三代的錯誤率高能否用于基因組組裝?

三代的錯誤率是隨機的堿基錯誤率,可達15%,但隨著自身覆蓋度的增加就可以進行糾錯,當覆蓋度在30X以上時,堿基準確度達99.99%以上。所以三代數據用于基因組組裝是完全沒有問題的。


5.動植物基因組的樣品選擇?

基因組精細圖的樣品要盡量與調研圖樣品為同一個體,植物樣品最好選擇無污染的組培苗、嫩葉等,而動物樣品最好選擇全血或者內臟組織。


6. Pacbio Sequel平臺的產出情況如何?

目前最新的Pacbio Sequel Ⅱ平臺CLR模式單張芯片產出在100-150G之間,CCS模式產出大概在250-300G之間,具體的產出與文庫質量、文庫大小相關。一般de novo項目文庫類型為CLR-20Kb、CLR-30Kb和CLR-40Kb,平均subreads長度在10-20Kb,subreads N50 長度在20-30Kb之間。

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